Розділ 1

ІСТОРІЯ ВІРУСОЛОГІЇ

Історія вірусології є досить незвичайною у тому розумінні, що згадки про вірусні захворювання датуються набагато раніше, аніж були відкриті віруси як агенти, які спричиняють хвороби – з одного боку, а з іншого боку, упродовж останнього часу віруси припинили розглядати винятково як патогени. Нині віруси розглядають як абсолютно рівноправних членів біосфери, кількість яких на порядок більша, аніж інших живих організмів. Умовно історію вірусології можна поділити на кілька етапів:
1.Дослідження на рівні організму (від перших відомостей – і до відкриття вірусів).
2.Дослідження на рівні клітини (від відкриття вірусів – і до встановлення їхнього хімічного складу).
3.Дослідження внутрішньоклітинних взаємодій.
4.Субмолекулярні дослідження.
5.Дослідження в епоху метагеноміки.

Дослідження на рівні організму

У стародавні часи люди не знали про існування вірусів, але в деяких випадках проводили дослідження причини виникнення захворювань та намагалися запобігати хворобам.

Можливо, перший письмовий запис про ураження вірусом дійшов до нас із фресками з м. Мемфісу – столиці Стародавнього Єгипту, приблизно 1400 р. до н.е. На них зображено священика на ймення Сіфах із типовими клінічними симптомами паралічу від поліомієліту.

Фараон Сіптах (Саптах) правив Єгиптом упродовж 1193–1187 рр. до н. е. і раптово помер у віці близько 20 років. Його муміфіковане тіло було недоторканим до 1905 р. Аналіз мумії показав, що ліва нога Сіптаха була вкороченою, а ступня розширеною подібно до копита коней — класичний симптом паралітичного поліомієліту (рис. 1.1).

Крім того, вважають, що фараон Рамзес V помер від віспи у віці, приблизно, 35 років у 1143 до н. е. – на мумії знайдені пустули, які дуже нагадують симптоми віспи (рис. 1.1).

Віспа була епідемічною в Китаї в 1000-х рр. до н. е. У відповідь на епідемії розвивається практика варіоляції – інгаляція сухих кірок від пустул віспи подібно до нюхального тютюну, або в пізніших модифікаціях, щеплення гною в пошкодження від подряпини на передпліччі. Було зауважено, що ті, хто вижив після спалахів віспи, захищаються від вторинного інфікування. Віспа, що досягла Європи зі Сходу приблизно в 710 р., була завезена в Америку в 1519 р. Фернандо Кортесом. За наступні два роки померло 3,5 млн ацтеків, як вважають, від віспи та кору – це фактично привело до кінця Ацтекської імперії. У XVIII ст. віспа була завезена в Австралію.

Варіоляція мала місце в Китаї, Індії та згодом у Туреччині, але лікарі Європи не знали цього й епідемії віспи тривали впродовж багатьох століть. У Європу практика варіоляції була завезена в XVII ст. леді Мері Вортлі Монтаґу з Османської імперії (рис. 1.2).

14 травня 1796 р. Едвард Дженер використав вірус коров'ячої віспи, отриманий із пустул на руці Сари Немес – доярки із с. Берклі, щоб з успіхом прищепити 8-річного Джеймса Філпса. 1 липня він запросив хлопця до себе та прищепив йому віспу від хворого (рис. 1.3). Однак Джеймс не захворів. Отже, було створено вакцину проти невідомого ще агента! Завдяки цьому відкриттю та масовій вакцинації проти віспи до 1979 р. це захворювання повністю ліквідували (рис. 1.4). Останній випадок захворювання був зафіксований у 1977 р. в Сомалі.

Створена Луї Пастером на початку XIX ст. вакцина проти сказу стала майже універсальною і застосовується в усьому світі і донині.

Роберт Кох разом із Луї Пастером визначили в 1880 р. чотири знамениті критерії, які нині відомі як «постулати Коха» і використовуються для доказів інфекційної етіології патогена.

Дослідження на рівні клітини

У 1892 р. наш співвітчизник Дмитро Йосипович Івановський (рис. 1.5) довів існування нового збудника на прикладі двох мозаїчних хвороб тютюну. Він помітив, що рослини тютюну хворіють. При вивченні рослинного соку бактерій не було знайдено, однак сік рослин викликав хворобу на здорових рослинах. Профільтрувавши сік рослин через фільтр Шамберлана, який затримує найменші бактерії і, заразивши ним рослини, він знову отримав симптоми. Учений прийшов до висновку, що збудник має незвичайну природу і назвав тип збудника «бактерії, що фільтруються». 1892 рік вважають роком народження науки «Вірусологія».

У 1898 р. голландський учений Мартінус Беєрінк підтвердив та розширив експерименти Дмитра Івановського і був першим, хто розвинув сучасне уявлення про вірус, який він визначив як contagium vivum fluidum (розчинний живий мікроб). Саме його вважають засновником науки «Вірусологія» (рис. 1.6).

1898 рік – Фредеріком Лефлером та Паулем Фрошем уперше був відкритий вірус людини та тварин – вірус ящура. У 1890-ті рр., під час іспансько-американської війни та будівництва Панамського каналу, була колосальна кількість смертей американців від жовтої лихоманки. Шляхом експериментальної передачі збудника мишам Волтер Рід продемонстрував, що жовту лихоманку викликає вірус, який передається москітами. Карл Ландстейнер й Ервін Поппер визначили, що поліомієліт викликає вірус. Вони були першими, хто довів, що віруси можуть уражувати людину так само, як і тварин. Франциск Пейтон Раус продемонстрував, що вірус (вірус саркоми Рауса) може викликати рак у курчат (за це відкриття він отримав Нобелівську премію в 1966). Ф. П. Раус – перший учений, який довів, що вірус може викликати рак у тварин.

Під час Першої світової війни майже одночасно в різних країнах були відкриті віруси, що уражують бактерії: 1915 р. – канадець Фредерік Туорт, 1917 р. – француз Фелікс д'Ерель. Цим вірусам було надано назву бактеріофаги – «пожирачі бактерій». Надалі, починаючи з 1930-х рр., віруси мікроорганізмів використовували і використовують нині як зручні моделі для дослідження великої кількості різноманітних вірусологічних аспектів, таких як структура, генетика і реплікація вірусів тощо (рис. 1.6).

Упродовж 30–40-х рр. XX ст. накопичувалася велика кількість даних щодо виділення, накопичення, кристалізації вірусів, вивчення їхньої природи з використанням методів фільтрації через фільтри та мембрани, седиментаційних та спектроскопічних методів.

Методи культивування вірусів на курячих ембріонах почали широко застосовувати після того, як А. Вудрафф та Є. Гудпасчур у 1931 р. описали зараження хоріоалантоїсної оболонки курячого ембріону вірусом курячої віспи.

У 40-х рр. минулого століття з'явилося багато робіт із культивування різноманітних вірусів – віспи, вісповакцини, простого герпесу, лихоманки долини Ріфт, весняно-літнього енцефаліту, Омської геморагічної лихоманки та ін. Було з'ясовано, що існує певна вибірковість у вірусів до тієї чи іншої тканини.

У 1931 р. Ернст Руска та Макс Кноль розробили перший просвічувальний (трансмісійний) електронний мікроскоп (EM, TEM). З 1940 р. стало можливим застосування цієї техніки для дослідження морфології та тонкої структури вірусів.

Джордж Хьорст у 1941 р. продемонстрував, що вірус грипу склеює червоні еритроцити крові. Це був перший швидкий і кількісний метод вимірювання кількості вірусів еукаріот. Згодом учені довели, що багато вірусів мають гемаглютинувальні властивості. Було виявлено, що віруси аглютинують не тільки еритроцити курей, але й інших видів птахів і ссавців, завдяки чому було розроблено метод гемаглютинації, який почали широко використовувати для ідентифікації вірусів.

Сальвадор Лурія та Альфред Херші в 1945 р. продемонстрували на прикладі вірусів бактерій (бактеріофагів), що вони видозмінюються, тобто можуть мутувати. Їхня робота доводить, що подібні генетичні механізми існують як у вірусах, так й у клітинних організмах.

У 1949 р. Фредерік Роббінс, Джон Ендерс та Томас Уеллер показали можливість культивування вірусу поліомієліту на культурі клітин (за цю розробку вони отримали Нобелівську премію в 1954). Розвиток зазначеного напряму привів до розробки методів ізоляції багатьох нових вірусів у культурі клітин.

У 1950 р. Андре Львофф, Луіс Сіміновіч і Нільс Кйелгард виявили лізогенізуючі бактеріофаги в Bacillus megaterium після дії м'яким ультрафіолетом і ввели термін профаг (Нобелівська премія, 1965).

Хоча поняття лізогенії дискутувалося, починаючи із 1920-х рр., ця робота прояснила та підтвердила існування помірних і вірулентних бактеріофагів та дала поштовх до подальших вивчень контролю експресії генів у прокаріотах. Зазначений напрям привів до гіпотези оперону, яка була запропонована в 1961 р. французькими вченими Франсуа Жакобом і Жаком Моно.

Рік 1952 – Ренато Дульбекко довів, що віруси тварин можуть формувати негативні колонії (бляшки) на одношарових культурах клітин подібно до бактеріофагів (Нобелівська премія, 1975). Робота вченого дозволила запровадити швидку кількісну оцінку вірусів тварин, використавши методику роботи з бактеріофагами.

Альфред Херші і Марта Чейз продемонстрували, що ДНК є генетичним матеріалом бактеріофага. Це один із перших прямих доказів того, що молекулярною основою спадковості є ДНК. Зазначений принцип є загальним для всіх клітинних організмів.

12 квітня 1955 р. поліомієлітна інактивована вакцина Джона Солка була офіційно дозволена для широкого використання.

У 1957 р. Ганс Френкель-Конрат та Роберт Вільямс довели, що суміш очищених білка і РНК-вірусу мозаїки тютюну (ВТМ) приводить до формування вірусних частинок. Відкриття – вірусні частинки можуть формуватися безпосередньо з окремих компонентів (субодиниць) без будь-якої зовнішньої інформації, за принципом мінімуму вільної енергії.

У цьому ж році Ейлік Ісаак і Джон Ліндеманн відкрили інтерферон. Інтерферони були першими цитокінами, які вивчаються детально.

Тоді ж Карлтон Гайдучек висуває гіпотезу, що «повільний вірус» (який згодом назвали пріоном) викликає хворобу «куру» (Нобелівська премія, 1976). Учений показав, що хвороба «куру» подібна до хвороби «скрепі» в овець, що «куру» можуть передавати шимпанзе і вона викликає хворобу нетиповий вірус.

Того ж 1957 р. Альберт Сабін розпочав клінічні випробування живої атенуйованої вакцини проти поліомієліту.

1958 р. – ВООЗ запропонувала програму знищення віспи в Америці.

У 60-х рр. XX ст. було розроблено велику кількість серологічних методів діагностики вірусів і вірусних захворювань, а саме в 1954 р. стало можливим виявлення антигенів у тканинах за допомогою антитіл, мічених флюоресцеїном (метод флюоресціювальних антитіл) (А. Куунс); у 1966 р. Аврамеасом Уріелем доведено можливість кон'югації антитіла або антигена із ферментом (що незабаром було використано Є. Енгваллем та Б.К. ван Вееманом для розробки імуноферментного аналізу); у 1975 р. Жорж Кьолер та Сезар Мільштейн запропонували методику отримання моноклональних антитіл, що підвищило чутливість і специфічність імуноферментного аналізу (ІФА).

Дослідження взаємодій вірусу із клітиною на молекулярному рівні

Сідней Бреннер, Френсіс Джекоб і Метью Мезельсон у 1961 р. продемонстрували, що бактеріофаг T4 використовує рибосоми клітини-хазяїна для синтезу вірусних білків. Це відкриття показало фундаментальний молекулярний механізм трансляції білку. У 1963 р. Барух Бламберг відкрив вірус гепатиту B (HBV) (Нобелівська премія, 1976). Учений запропонував першу вакцину проти HBV, яка є і першою вакциною проти раку (через асоціацію гепатиту B з раком печінки). Тоді ж було впроваджено першу вакцину проти кору.

Марк Пташне (1967) ізолює і вивчає білок-репресор бактеріофагу λ. Разом із Волтером Гілбертом він ілюструє ключову роль білка-репресора в регуляції генів та індукції профагу. Теодор Дінер досліджує віроїди – інфекційні агенти у рослин, що не мають у своєму складі білків, а лише низькомолекулярну одноланцюгову рибонуклеїнову кислоту (РНК).

Дослідження на субмолекулярному рівні

Детальні дослідження фізико-хімічних властивостей вірусів стали можливими наприкінці 60–70-х рр. XX ст. за допомогою використання методу електрофорезу (У. К. Леммлі), рентгеноструктурного аналізу (Р. Франклін, М. Вілкінс) та ядерного магнітного резонансу (ЯМР). Тоді ж були розроблені методи визначення довгих послідовностей ДНК-секвенування.

У 1983 р. Люк Монтаньє і Роберт Галло майже одночасно повідомили про відкриття вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ; Human immunodeficiency virus, HIV), агента, який спричиняє СНІД. Тільки через два роки після початку епідемії СНІДу збудник був ідентифікований і названий вірусом імунодефіциту людини.

Останнім часом дедалі більшого поширення набувають найновіші методи діагностики, що базуються на виявленні в досліджуваних клінічних і рослинних зразках специфічних послідовностей вірусного геному. Найбільшого розповсюдження набула полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР; polymerase chain reaction, PCR). За понад 20 років, які пройшли від часу відкриття ПЛР (1983, Кері Мюлліс, Cetus, California), реакція знайшла застосування в усіх галузях біології, опубліковано тисячі робіт, у яких її використовували.

У 1985 р. Американський відділ сільського господарства надав першу ліцензію на продаж генетично модифікованого організму (GMO) генетично модифікований вірус для вакцинації проти герпесу свиней – перший комерційний GMO. Того ж року Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) починає «Розширену програму з імунізації», плануючи імунізувати кожну дитину у світі проти поліомієліту, туберкульозу, правця, кору, дифтериту. У 1986 р. Роджер Бічі, Роб Фралей і колеги демонструють, що рослини тютюну, трансформований геном білка оболонки вірусу мозаїки тютюну, стійкі до інфекції ВТМ. Ця робота приводить до кращого розуміння стійкості рослин до вірусів – головної мети селекціонерів упродовж багатьох століть. У 1989 р. вірус гепатиту C (HCV), який вважали причиною більшості випадків «ні A, ні B»-гепатитів, був однозначно ідентифікованим. Це перший інфекційний агент, що був ідентифікований за допомогою молекулярного клонування геному.

У 90-х рр. минулого сторіччя відбулися перші (офіційно дозволені) спроби генної терапії у людини – дитину з комбінованим імунним дефіцитом (SCID) лікували, використовуючи вірусний вектор. З використанням секвенування розшифровано повну послідовність нуклеотидів геному вірусу віспи (вірус має 185,578 пар нуклеотидів). Також була розшифрована нуклеотидна послідовність найбільшого відомого на той час вірусного геному вірусу, який уражує водорості: Parameciumbursaria Chlorella virus1 – 330,742 нуклеотидні послідовності. Спостерігаються величезні технічні успіхи у встановленні нуклеотидних послідовностей порівняно з 1977 р.

Закінчення другого тисячоліття ознаменувалося тим, що загальна кількість ВІЛ-інфікованих у світі перевищила 36 млн. В Україні кількість ВІЛ-інфікованих зросла із 44 у 1994 р. до 38-110 тис. осіб. Знайдені перші докази того, що ВІЛ бере свій початок в Африці, походить від шимпанзе і вперше перейшов до людей близько 50 років тому. Офіційна влада Зімбабве повідомила, що із 12 млн мешканців країни 1,6 млн осіб є ВІЛ-інфікованими.

Дослідження в епоху метагеніки

Нове тисячоліття розпочалося із цікавих та, на перший погляд, дивних відкриттів. Закінчення проекту із розшифрування геному людини (Human Genome Project, HGP) показало, що геном складається із 3,2 млрд нуклеотидів. Близько половини геному людини складається із вірусів – або, принаймні, послідовностей, що пов'язані з вірусними або скороченими вірусними послідовностями, або зі стародавніми вірусами, які містяться в нашому геномі упродовж мільйонів років. І тільки 2,5 % вірусів послідовностей кодують унікальні людські гени.

Розробка методів секвенування нового покоління (СНП) дозволила проводити великомасштабні дослідження з меншими затратами. Проект аналізу великомасштабного секвенування людського мікробіому (Human Microbiome Project, HMP) надав дуже цікаві спостереження за убіквітарністю мікроорганізмів. У певному сенсі HMP є продовженням проекту геному людини (HGP). «Мікробіом» – це нове слово, що позначає послідовність усіх разом узятих мікроорганізмів, без урахування окремих зразків. Із 2010 р. мікробіому та його ролі приділяють багато уваги.